Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒说明书                                                                            

Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit 

货号：K2579     

保存：2-8  ℃避光保存 

组分说明

Cat.No.                         K2579

KitSize                         50

4×BindingBuffer                 10ml

7-AADViabilityStainingSolution     500 μl

AnnexinV-PE                     250 μl

产品简介 

   AnnexinV-PE/7-AAD 流式检测试剂盒是一种采用 Annexin-PE 与 7-AAD 双染法进行细胞早期凋亡分析的检测试剂盒。

   细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使 PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使 PS 暴露在细胞膜外。AnnexinV 具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性，对 PS 有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。PS 转移到细胞膜外不是凋亡所*的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就被破坏。7-AAD （7-amino-actinomycinD）是一种核酸染料，可进入死细胞内与                                 DNA 结合，能够对坏死和凋亡晚期的细胞进行染色。7-ADD 与PI有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI 窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI 的最佳替代品，因此通常将Annexin V-PE 与   ADD 配合染色，以区别凋亡早期细胞与坏死细胞和凋亡的晚期细胞。

注意事项 

1.  消化细胞时不能用含EDTA 的胰酶。 

2.  本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。

3.  需自备PBS 和去离子水。

4.  荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

5.  PI 对人体有刺激性，请注意适当防护。

6.  请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤 

1. 细胞样品的准备：

     a. 对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000×g 左右离心3-5 分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μl 左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1 ml 4℃预冷的    PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。再次加入1ml4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞。

    b. 对于悬浮细胞：1000×g 左右离心3-5 分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约                            50 微升左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1 ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5 毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约                                50μl 左右的   PBS，以避免吸走细胞。再次加入1ml4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞。

2.  用去离子水按1:4 稀释  BindingBuffer（4mlBindingBuffer+12ml 去离子水）；

3.  用 250μlBindingBuffer 重新悬浮细胞，调节其浓度为1×106/ml；

4.  取 100 μl 的细胞悬液于 5ml 流式管中，加入 5 μlAnnexinV-PE 和 10 μl7-AAD 溶液；

5.  混匀后于室温避光孵育 15 分钟；

6.  在反应管中加 400μlPBS，流式细胞仪（FACS）分析。

    

实验代做服务：