酶标醋酸纤维膜免疫电泳技术

一，酶标醋酸纤维膜免疫电泳技术的原理

由于醋酸纤维膜是由醋酸纤维素组成的，对蛋白质分子的移动几乎无阻力，差不多所有在电场中能泳动的物质均能在醋酸纤维膜里自由移动，因此在免疫电泳中，醋酸纤维膜是一优良的载体。将酶标记抗体与相应抗原在醋酸纤维膜进行电泳，生成免疫复合物，用酶底物显色，能大幅度地提高检测的灵敏度和可靠性。使用酶标醋酸纤维膜免疫电泳技术（Enzyme-Linked-Cellulosa-Acetate-membrane-Immunoelectropheresis,简称ELCAIE），笔者文章公布的检出量是0.3ng的RMV，其实当时的实验结果已经显示0.1ng的RMV检测量。

二，酶标醋酸纤维膜免疫电泳技术的程序（检测RMV）

1,器材与设备

（1）电泳仪（包括电泳槽）；

（2）醋酸纤维膜（10cm×14cm,厚度10dmm；

（3）微量进样器；

（4）竹钳。

2，材料与试剂

（1）       以0.2mol/LpH7.2硼酸缓冲液连续稀释的RMV溶液（10ng/ml→1×10⒌ng/ml）；

（2）       HRP标记的RMV免疫的兔IgG（戊二醛一步法交联）；

（3）       洗涤液，每1000ml中有500ml 0.1mol pH8.2巴比妥缓冲液和85g食盐，其余为蒸馏水；

（4）       底物与供氢体溶液（H2O2和DAB－4HC1）；

（5）       0.1mol/L pH8.6巴比妥钠盐酸缓冲液。

 3，实验程序

（1）       将醋酸纤维膜用软铅笔轻轻划好点样线，酶标抗体样点距膜边3cm,抗原样点与酶标抗体样点对距3cm,两个样点横距1.5cm.

（2）       将上述薄膜浸入0.1mol/L pH8.6巴比妥钠盐酸缓冲液中浸湿，取出薄膜，用滤纸吸去表面水分，但不要干燥。

（3）       用微量进样器点样，抗体每样点用酶标抗体液10ul,抗原样点*点是对照，滴加10ul健青菜蛋白溶液；第二、三、四、五样点滴加RMV抗原溶液各10ul,浓度分别为1×10⒌ng/ml、1×10⒋ng/ml、1×10⒊ng/ml、100ng/ml；第六、七样点分别滴加5ul、3ul、，浓度为100ng/ml；第八样点滴加10ul,浓度为10ng/ml；第九样点滴加5ul,浓度为10ng/ml.

（4）       点样完毕，将薄膜置于电泳槽中央棱边，使其架空，然后用滤纸作盐桥，电泳缓冲液为0.1mol/L PH8.6巴比妥钠盐酸缓冲液，抗原端接负极。

（5）       待作为盐桥的滤纸全部湿润后，接通电源，控制电压150V，电泳时间1.5h左右。

（6）       电泳完毕，将薄膜浸洗在洗涤中过夜。

（7）       次日将薄膜在清水中漂洗3－5min后取出。

（8）       zui后滴加H2O2（0.3%）和DAB－4HC1溶液，各占一半量，几分钟内就会显示结果。