货号：  YJS2392                                               规格：100管/96样

山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase，SDH）试剂盒说明书

微量法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

SDH（EC 1.1.1.14）催化山梨醇脱氢生成果糖，是调控生物体内山梨醇含量的关健酶之一。

测定原理：

SDH催化山梨醇脱氢生成果糖，同时还原NAD⁺生成NADH，测定340nm吸光度增加速率可以计算SDH活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，

加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）在试剂二中加入7.6mL试剂一和11.4mL蒸馏水充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；用不完的试剂4℃保存一周；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和190μL试剂二，混匀，立即记录340nm

处20s时的吸光值A1和2min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

SDH 活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）SDH 活力的计算

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

SDH（nmol/min/mL）= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V 样÷T=1608×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 SDH 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

SDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T

=1608×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

SDH（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总)÷T

=1608×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

SDH（nmol/min/10⁴cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T

=3.216×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10 ^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、血清（浆）SDH 活力的计算

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

SDH（nmol/min /mL）= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V 样÷T=3216×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 SDH 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

SDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T

=3216×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

SDH（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T

=3216×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

SDH（nmol/min /10⁴cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T

=6.426×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10 ^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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