猪外周血造血干细胞分离液说明书

猪外周血造血干细胞分离液说明书
【产品规格】
200ml/Kit
【产品组成】
为方便广大用户使用，试剂内容如下：

【实验前准备】
A．适用仪器
zui大离心力可达 1200g的水平转子离心机
B．耗材

【检验方法】
全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。
首先取抗凝血按体积比 1:1的比例加样本稀释液（产品编号：2010C1119）混匀，
根据稀释后的样本量大小，分以下两种情况：
情况 A：稀释后的血液样本量小于5ml 时，实验方法如下：
1.取一支15ml离心管，先加入与稀释后样本等量的分离液（注：分离液zui少不得少于  3ml）。
2.用吸管小心吸取稀释后的血液样本加于分离液液面上，400-500g，离心20-30min（注：
根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离
心条件需客户自行摸索，以达到分离效果）。
 3.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。*层为血浆层。第二层为环状乳白色目的

细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。
4.用吸管小心吸取第二层环状乳白色目的细胞层到另一 15ml离心管中，往所得离心管中
加入 10ml清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。
5. 250g，离心 10min。
6.弃上清。
7.用吸管以5ml清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。
8. 250g，离心 10min。
9.重复  6、7、8，弃上清后以 0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。
10.差异贴壁法纯化细胞
（1）用干细胞无血清培养基或干细胞*培养基以 1.5-3×10 6个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。
（2）2-4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。
（3）10-24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。
（4）不贴壁的为淋巴细胞。
注：
a)
无血清培养基中不含任何动物成分，为得到更佳培养效果可添加10%自体血浆或
2-8% 经筛选的胎牛血清。
b)
c)
*培养基中含 2-20% 胎牛血清（血清具体含量由所培养的目的细胞而定）。
由于每种细胞的贴壁时间存在差异可将所得细胞分开已达简单的纯化目的，此法成
本相对较低。如需获得高纯度目的细胞则需在使用分离液后选用免疫磁珠阳性或阴
性分选。
情况 B：稀释后的血液样本量大于等于 5ml时，实验方法如下：
1.取一支适当的离心管，先加入与稀释后样本等量的分离液。
2.将经稀释后的血液样本小心加于分离液之液面上，450-650g（zui大离心力可至 1000g），
离心 20-30min。（注：根据血液样本量确定离心条件，血液量越多，离心力越大，离心
时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到分离效果。加入血液样本后，样
本及分离液总体积不得超过离心管总体积的三分之二）。
3.剩余步骤同“情况  A”中步骤 3至步骤  10。
  【注意事项】

1.全过程样本、试剂及实验环境均需在   20±2℃的条件下进行。为获得的实验结果，
在取血 2h内进行实验，血液存放时间越长，细胞分离效果越差。血液放置超过   6h
后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
2.本实验不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心
管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会
变成毛面，影响细胞分离效果。
3.吸取过多的目的细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒
细胞数量增加。
4.吸取过多的目的细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。
5.分离液用量大于稀释后的血液样本时，分离效果更佳。
6.如实验后干细胞得率或活性过低，请以寻求帮助。
【储存条件及有效期】
18-25℃保存，有效期 2年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启
封后置常温保存。如 4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
【参考值（参考范围）】
本实验外周血干细胞提取率大于 80%。
下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。

【相关实验技术方案】
1.所获得干细胞的培养技术。
2.所获得干细胞的核酸提取技术。
3.所获得干细胞的鉴定方法
A.流式细胞技术
B.免疫组化技术
C.原位杂交技术
D.PCR技术

注：上述技术方案详情请登陆本搜索“细胞分离、
纯化、扩增、鉴定及生物治疗技术手册”，并在说明书项目栏下下载使用。
【可能存在的问题及解决方法】
1.由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：

2.本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地
区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离
心时间，对离心转速进行调整。
3.本分离液依照标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可
能出现红细胞沉降不*的情况，可以适当加大离心转速。
注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以 50-100g为基数，直至达到分离效果，
离心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min为准。